La leche contiene vitaminas (principalmente tiamina, riboflavina, ácido pantotéico y vitaminas A, D y K), minerales (calcio, potasio, sodio, fósforo y metales en pequeñas cantidades), proteínas (incluyendo todos los aminoácidos esenciales), carbohidratos (lactosa) y lípidos. Los únicos elementos importantes de los que carece la leche son el hierro y la vitamina C.[1]

  Las proteínas se pueden clasificar de manera general en proteínas globulares y fibrosas. Las proteínas globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas esferoidales y no establecen interacciones intermoleculares como son los puentes de hidrógeno (característicos de las proteínas fibrosas) siendo solubilizadas en suspensiones coloidales.

  En la leche hay tres clases de proteínas: caseína, lacto albúminas y lacto globulinas (todas globulares). La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteinas son un grupo de proteínas que están químicamente unidas a una sustancia que contiene ácido fosfórico. En la caseína la mayoría de los grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina. La caseína en la leche se encuentra en forma de sal cálcica (caseinato cálcico). La caseína representa cerca del 77% al 82% de las proteínas presentes en la leche y el 2,7% en composición de la leche líquida.

  La caseína está formada por alpha(s1), alpha(s2)-caseína, ß-caseína, y kappa-caseína formando una micela o unidad soluble. Ni la alfa ni la beta caseína son solubles en la leche, solas o combinadas. Si se añade la kappa caseína a las dos anteriores o a cada una de ellas por separado se forma un complejo de caseína que es solubilizado en forma de micela. Esta micela está estabilizada por la kappa caseína mientras que las alfa y beta son fosfoproteínas que precipitan en presencia de iones calcio.

  La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada negativamente y solubilizada como sal cálcica. Si se añade ácido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza ( los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita.

Ca2+ Caseinato + 2HCl Caseína + CaCl2

  La conformación de la caseína es similar a las proteínas desnaturalizadas globulares.

El alto numero de residuos de prolina en la caseína causa un especial plegamiento en la

cadena de proteína e inhibe la formación de una fuerte y ordenada estructura secundaria.

  La caseína no contiene puentes di sulfuro. De igual manera la falta de estructura    secundaria es importante para la estabilidad de la caseína frente a la desnaturalización por calor. La carencia de estructura terciaria facilita la situación al exterior de los residuos hidrofóbicos lo que facilita la unión entre unidades proteicas y la convierte en prácticamente insoluble en agua. En cambio es fácilmente dispersable en álcalis diluidas y en soluciones salinas tales como oxalato sódico y acetato sódico.

  La función biológica de las micelas de caseína es transportar grandes cantidades de Ca y P altamente insoluble en forma liquida a los lactantes y formar un coagulo en el estomago para favorecer una nutrición eficiente. Además de caseína, Ca y P la micela formada también contiene citrato, iones, lipasa, enzimas plasmáticos y suero. Estas micelas ocupan del 6-12% del volumen total de la leche.

  Las proteínas que aparecerán en el sobrenadante cuando precipitemos la caseína en medio ácido son proteínas globulares, hidrofilicas y fácilmente solubles en agua así como susceptibles de desnaturalización por calor. Las principales son ß -lacto globulina, alphalactalbumina, bovine serum albumin (BSA), y inmunoglobulinas (Ig).

  La caseína se emplea en la industria para la fabricación de pinturas especiales y en el apresto de tejidos, la clarificación de vinos, la elaboración de preparados farmacéuticos y la fabricación de plásticos. La pintura de caseína ha sido usada desde la antigüedad por los egipcios.

Fundamentos de los métodos utilizados.

Precipitación de la Caseína por punto Isoeléctrico.

La mayor parte de las macromoléculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se dispersan en agua. Una característica de las proteínas y otros biopolímeros es que la carga total que adquieren depende del pH del medio.

  Así, todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas de cualquier ligando que se encuentre unido a la proteína de forma covalente (irreversible).

   Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos.

  Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente ácido debido a que los grupos COOH de los aminoácidos aspártico y glutámico estarían en su forma neutra pero los grupos amino de Arginina y lysina estarían protonados (-NH3+).

  De igual forma si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto estaría cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estarían desprotonados (COO-) y los grupos amino estarían en su forma neutra (NH2).

 De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero. A este pH se le denomina punto isoeléctrico (pI).

 En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación.[2]

Cuantificación de proteínas, por el método de Biuret.

Biuret es un reactivo aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos no muy largos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida.

  Es constituido por los reactivos: a) Hidróxido potásico (KOH) b) Sulfato cúprico (CuSO₄), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC₄O₆·4H₂O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y cambia a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. El Hidróxido de Potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.

  Se utiliza normalmente en el ensayo de Biuret, un método colorimétrico que permite determinar la concentración de proteínas de una muestra mediante espectroscopia ultravioleta-visible a una longitud de onda de 540 nm (para detectar el ión Cu²⁺).[3]

   Como ya antes se menciono el reactivo de Biuret se compone de hidróxido de sodio y sulfato de cobre (solución alcalina fuerte), el grupo amino  de las proteínas reacciona con los iones del cobre del reactivo dando el color púrpura, la cantidad del color producido es proporcional al número de enlaces peptídicos, y por lo tanto a la cantidad de proteína.

Electroforesis

Una de las técnicas más sencillas para la separación (y posterior cuantificación) de proteínas es la electroforesis (técnica en la cual una partícula cargada se hace desplazar a través de un medio aplicando un campo eléctrico).

Cuando se aplica un campo eléctrico a un medio que contiene partículas cargadas, las partículas cargadas negativamente migran hacia el ánodo o polo positivo mientras que, las cargadas positivamente migran hacia el

electrodo negativo (cátodo).

Este principio se puede aplicar para separar las fracciones de proteínas puesto que los aminoácidos (aa) constituyentes de la proteínas, y por tanto las proteínas, son compuestos anfóteros que se comportan como ácidos (ceden protones y quedan con carga negativa) o bases (captan protones y

quedan con carga positiva) dependiendo del medio en el que estén.

Si una disolución de proteínas se somete a la acción de un campo eléctrico la tasa de migración durante la electroforesis depende de:

·          La carga neta de la molécula, su forma y tamaño

·          La fuerza del campo eléctrico

·          Características del soporte.

La cantidad de carga neta en la molécula es variable y depende del pH del amortiguador. Si el pH del medio es menor que el punto isoeléctrico, las proteínas se comportan como cationes y, si el pH del medio es superior al pI, se comportan como aniones. La carga de la proteína se hace más negativa a medida que el pH del amortiguador se hace más básico.

A pH 8,6 (básico) todas las proteínas migran hacia el ánodo (tienen carga global negativa). La albúmina, con pI de 4,7 tendrá una mayor carga negativa que la gamma-globulina, que tiene un pI de 7,2. En definitiva, lo anterior explica que la albúmina recorra una mayor distancia que la gamma-globulina cuando se sitúen en un campo eléctrico.

Hay numerosos sistemas de electroforesis de proteínas comercialmente disponibles. En clínica el suero es la muestra de elección. Se puede usar plasma pero, en ese caso se observará una banda adicional de fibrinógeno.

También se puede analizar orina y líquido cefalorraquídeo si se aumenta su contenido proteico (hasta 20-30 g/l) por ultracentrifugación, diálisis u otras técnicas de concentración.